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流式细胞分选
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应用简介
       用免疫磁珠做细胞分选(MACS)是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合,或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱/试管上,实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离。
技术原理
       流式分选当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中,被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液,在鞘液的包裹和推动下,细胞被排成单列,以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷,当液滴流经过带有几千伏的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,没有充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离。
       磁珠分选免疫磁珠细胞分选法是把细胞用超级顺磁性的(MACS微型磁珠)特异性地标记,磁性标记完后,把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后,滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来,这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份。


实验方法
       本次实验是用免疫磁珠做细胞分选(MACS)。实验流程如下:

技术总结
       1、如果分离细胞用作培养,全过程在超净台中完成。
       2、超微磁珠及微小磁场系统适合于少量细胞分离(如106-107),通常已适用于大多数实验研究;此外各公司尚有大磁珠及大磁场供应,可用于更大量细胞的分选;除分离柱外,也有试管及其它设备用于分选;根据我们应用的经验,分离柱由于提供了较大的接触面,在细胞分选上具有较多优点。磁场也可以自制,用一般的磁铁即可做成简易磁场,可提供足够的磁力。
       3、磁珠分离系统分离的细胞纯度可以达到80~99%,得率在60~90%左右,仅次或相当于流式细胞仪(FACS)的分选效率,与FACS相比,MACS设备简单,耗时极短,故而应用广泛。MACS也可用做FACS分选前的预分离,以减少FACS所用时间。另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度,通常可达95-99%。
       4、在分离柱尾接上限速针头,收集的首次流下的细胞即为阴性选择细胞,一般纯度低于阳性选择。
       5、分离柱一般只能一次应用,再用时降低分离效率;
       6、分选下的细胞可用荧光标记抗体(一抗或二抗)标记后FACS鉴定纯度;我们用荧光抗体直接标记细胞后,用二抗包被磁珠分选出细胞,直接做FACS分析,也可实现分选和纯度检测。
       7、阳性选择后,如需用第二种表面标志继续分离,可以用剪切酶剪切下之结合的磁珠和一抗,再次进行下一轮分选。如需进行细胞功能分析,也可经培养12~24小时,使结合的磁珠脱落后进一步使用阳选的细胞做研究。