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细胞凋亡检测
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应用简介
       细胞凋亡是细胞主动实施的一种程序性死亡,是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。
技术原理
       AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。因此AnnexinV作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinⅤ进行荧光素FITC标记,以标记了的AnnexinV作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙锭(PropidiumIodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
基本特征:
       细胞凋亡具有特定形态学和生物化学特征:
       1、形态学特征:凋亡常发生于单个细胞,其形态变化分3个阶段:第一阶段可见凋亡细胞与相邻细胞分离,细胞皱缩,染色质浓缩,聚集于核膜周围呈半月形,亦可发生核断裂,核仁裂解。第二阶段可见细胞表面突出,分成多个膜包绕小体,含有部分核和/或完整的细胞器,称为凋亡小体(apoptosisbodies)。第三阶段,凋亡小体被组织细胞或吞噬细胞吞噬降解。在有内皮的腔中如胆管、凋亡小体可以排入腔内;在组织培养中,凋亡细胞与邻近细胞和培养基质相分离。整个凋亡过程在几小时内全部完成。与坏死相比,凋亡的显著特点是整个过程中浆膜保持完整,减少了细胞成分外漏,因此,没有或仅有很轻炎症反应。而坏死是病理因素作用使细胞膜失去完整性而引起细胞溶解,通常波及相邻细胞,表现为细胞肿胀,细胞器溶解,细胞膜破裂,伴有组织炎症。由于凋亡过程迅速,凋亡小体较小,因此,在光镜下不易发现细胞凋亡。
       2、生物化学特征:细胞凋亡的生物化学特征是DNA断裂,这种断裂不是随机的,它与细胞内核酸内切酶的激活有关。在内切酶作用下,细胞核中的DNA裂解成核小体大小的片段,每个核苷酸片段大约有180~200个碱基对。在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的阶梯样的DNA区带。而坏死的细胞,DNA被溶酶体释放的多种水解酶随机降解,DNA电泳呈模糊、微弱的踪迹,不能形成阶梯状,以此可区别细胞凋亡和坏死。但是核小体断裂是凋亡的晚期表现,并不普遍存在。
实验方法

注意事项
1、诱导培养细胞时间要准确。
2、AnnexinV是光敏物质,在操作时要注意避光。
3、细胞凋亡是一个动态的过程,反应一小时后荧光强度就开始衰变,荧光显微镜下观察细胞时,由于荧光易碎灭,观察时要尽量快。
4、整个操作过程动作要尽量轻柔,切勿用力吹打细胞,尽量在4℃下操作。