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慢腺病毒细胞株构建
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技术原理
       慢病毒包装:使用3质粒慢病毒包装系统,慢病毒系统使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G,过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统,将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中,培养48h后,收集上清。纯化后留取部分检测病毒滴度,其余病毒冻存于-80℃冰箱中。
       滴度检测:将病毒颗粒使用梯度稀释,分别感染293T细胞,感染72h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。
       细胞感染:在病毒感染前一天对细胞进行计数,接种约10000个细胞于12孔板中,培养过夜后使用无血清培养基稀释病毒,加入12孔板中对细胞进行感染,病毒数量根据推荐细胞的感染MOI加入(若无推荐MOI,需做病毒梯度:1,5,10,50,1005个梯度对细胞感染),感染6h后去除含病毒溶液,加入完全培养基细胞培养,培养48h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选,筛选约2周时间。细胞筛选好后,使用定量PCR和Westernblot检测目的基因的稳定表达情况。
实验方法

技术总结:
       1、MOI(multiplicityofinfectin),感染复数,含义为感染时病毒和细胞数量的比值。多数细胞查阅文献也能获得推荐的MOI,但不同实验室,不同病毒测算出的MOI也有差别。所以建议根据自己包装的慢病毒重新检测MOI。
       2、为了能获得最佳效果的单克隆稳定细胞株,可以增大筛选的总量。