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流式检测细胞凋亡实验怎么去做
时间:2024-05-23 09:25:15点击量:60次


原理:Annexin V 属于 Ca2+ 结合蛋白家族,可与磷脂(PL)发生可逆的Ca2+ 依赖性结合。在健康细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)主要位于质膜的胞质侧,当细胞凋亡开始时,PS 从质膜内部转移至外部,而 Annexin V 对 PS 具有高亲和力,可与暴露在外部细胞环境的 PS 结合。7-AAD(7-氨基-放线菌素D)具有高 DNA 结合常数,并且被完整细胞有效排除,可以排除无活力的细胞。在早期细胞凋亡中,PS 暴露于细胞表面,但质膜不包括 7-AAD。这些细胞用 Annexin V 染色,从而区分早期细胞凋亡中的细胞(Annexin V 阳性,7-AAD 阴性)。在晚期细胞凋亡中,细胞膜丧失完整性,从而允许 7-AAD 进入并与 DNA 结合,同时允许 Annexin V 与细胞膜上的 PS 结合(Annexin V 阳性,7-AAD 阳性) 。然而,该测定法不能区分经历凋亡的细胞和由于坏死而死亡的细胞,在任一情况下,死细胞都会被 Annexin V 和 7-AAD 染色。

实验步骤:

1.制备阳性细胞:选择1盘10cm皿细胞,打开培养皿盖子,放置于紫外灯下照射2小时。或使用碧云天细胞凋亡阳性对照试剂盒提前处理阳性细胞。

2.收集细胞:将待测细胞(包括阴性与阳性对照细胞)的上清分别收集至15mlEP中,使用2mlPBS冲洗细胞,加入1ml不含有EDTA的胰酶,至37°培养箱中消化,至细胞大片脱离皿底。用刚才收集的上清液终止消化后,转移至刚才的15mlEP管中。2000rpm,室温,离心5min,弃上清。

3.清洗细胞:用1ml常温1*PBS重悬细胞,转移至1.5mlEP管中。2000rpm,室温,离心5min,弃上清。

4.细胞计数:使用细胞计数仪进行细胞计数,每组取2*106细胞。

5.染色:使用200ul缓冲液重悬细胞(2*106),所有实验组与阴性对照需要双染,阳性对照需要设置两个染料的单染管。双染管加入5ul Annexin V染料,5ul7-AAD,单染管加入单独的5ul Annexin V染料或5ul7-AAD,标清楚单染染料名称。用手弹匀,避光染色15min。(染色过程中准备流式管和滤膜。打开流式细胞仪,检查鞘液和废液情况)

6.染色完毕后,加入1mlPBS,2000rpm,室温,离心5min,弃上清。再加入100ulPBS重悬,过200目滤网。

7.上机设置:打开SSC,FSC,BB515下的FITC通道,以及7-AAD通道,其他用不到的通道删除。使用log模式,全选A,H,W指标。设置初始读值:一般癌细胞SSC设置180-200,FSC设置180-200,FITC电压值设为280左右,7-AAD设置350左右。右侧设置如下:

上机顺序,1-阳性Annexin V单染管,2-阳性7AAD单染管,3-阴性,4-实验对照,5-实验组……

8.电压及补偿调节:看各自通道的峰图调节电压,使阴性峰的峰尾在102和103之间,峰靠右则降低电压,峰靠左则升高电压。上Annexin V单染管时,调节7AAD-FITC补偿,输入X%,使十字门一二象限没有细胞信号。上7AAD单染管时,调FITC-7AAD补偿,输入X%,使十字门一四象限没有细胞信号。若实验时间有限,来不及调节好补偿。FITC-7AAD和7AAD-FITC都输入1%,以保留补偿门,可在FlowJ软件上再次调节。

9.电压和补偿调节好后,不可再次改变。若电压发生改变,补偿应该再次调节。每管细胞收30000-50000个。

10.按照清洗流程标准清洗流式细胞仪,拷贝数据。

11.FlowJ调节补偿,打开FlowJ的界面,把两个单染管拖入补偿组。自动调节补偿后应用至所有实验组。

根据阴性对照设置十字门,保证一二四三个象限中细胞数小于0.4%。应用阴性对照圈门至所有实验组。输出各组十字门结果至Layouts,合理排列后,调节字体大小与格式,Tiff格式输出。

文章发布于:细胞实验外包    想了解更多请关注:http://www.do-gene.cn