问题一：无信号/荧光强度弱

1. 信号补偿不正确
建议：检查流式细胞仪上单色阳性对照是否设置正确，通道和补偿设置是否能正确地捕获所有事件

2. 用于检测的抗体不足
建议：增加抗体量/浓度

3. 无法接近细胞内靶标
建议：检查靶蛋白是否在细胞内;对于胞内染色，确保有足够的透化作用;为防止细胞表面蛋白质的内化，所有操作都必须在冰上完成，或使用4℃的试剂，以阻止反应
注意：在实验室试剂中添加叠氮化钠可阻止表面抗原的修饰和内化，但会导致荧光强度的损失。对于细胞系的染色，胰蛋白酶通常可以引起细胞表面蛋白的内化，特别是细胞表面分子的内化，并且可能需要更温和的分离方法

4. 细胞内染色（荧光染料结合分子太大）
建议：用于细胞内染色实验的荧光染料应具有较小的分子量，大分子量的荧光染料会降低抗体的动力及其进入细胞的可能性

5. 激光器未对齐
建议：确保流式细胞仪上的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查微珠来调整路线；如果激光器未正确对齐或发生偏移，则可能需要考虑维修机器

6. 靶蛋白不存在/低水平表达
建议：确保组织/细胞类型表达的靶蛋白处于足够检测的量

7. 可溶性/分泌性靶蛋白
建议：确认靶蛋白是否可溶并由细胞分泌，靶蛋白需要嵌合在细胞膜上或存在于细胞质里，以便能很容易地被流式细胞仪检出；通过高尔基体封闭步骤，例如加入BrefaldinA，可以改善细胞内的染色信号

8. 补偿过高/增益过低
建议：使用阳性对照，并正确设置流式细胞仪，利用补偿确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号（在合理范围内，应谨慎操作）

9. 荧光染料的荧光消退
建议：抗体可能保存时间太久或没有避光，需要使用新鲜的抗体

10. 一抗和二抗不相容
建议：使用的二抗应与一抗来源物种相同（例如，一抗为免源，则应该使用抗兔源二抗）

问题二：荧光强度高

1. 抗体浓度过高
建议：应减少每个样本中添加的抗体量

2. 过多抗体被困
建议：确保洗涤步骤充分，并在洗涤缓冲液中加入吐温或triton，以避免抗体上的大荧光染料分子被困在细胞内

3. 封闭不足
建议：加入1%至3%含抗体的封闭液并增加封闭步骤

4. 阻断不充分
建议：更换阻断剂或者增加阻断的时间

5. 电压太高/信号超出范围
建议：确认仪器设置正确;加入对照管以优化每个荧光素的仪器设置，再使用对照进行电压优化，以确定检测器的最佳设置

6. 增益过高
建议：确保使用适当的阳性对照进行仪器设置；在仪器操作界面上降低增益以降低信号强度

7. 激光功率过高
建议：降低激光功率（在仪器允许的情况下），从而降低信号强度

问题三：背景高/阳性细胞高百分比

1. 增益设置过高/补偿过低
建议：使用阳性对照并正确设置流式细胞仪；使用补偿减少小颗粒背景并减少增值，以降低信号

2. 抗体过量
建议：降低抗体浓度，还可以将去污剂添加到洗涤缓冲液中，以确保洗去过量的抗体

3. 非特异性染色
建议：设置同型对照以排除与Fc受体、荧光团或其他细胞成分结合的非特异性抗体

4. 死细胞、粘连体、碎片引起
建议：在实验之前将细胞用过滤器去除团块；细胞样本保持在4℃或冰上；加入活性染料，排除死细胞；尽可能使用新鲜分离的细胞，避免冻融;重悬时，使用不含Ca2/Mg2*的2%FBS缓冲液；在样本中加入DNase

5. 自发荧光

建议：避免过度固定；用未染色对照确定背景自发荧光水平

问题四：在应该只有一个细胞群的情况下欢察到两个或多个细胞群

1. 存在一种以上表达靶蛋白的细胞群
建议：检查样本中包含的细胞类型的预期表达水平，如有必要，确保细胞充分分离

2. 出现细胞双峰

建议：（细胞双峰在印迹上显示为第二大细胞群，其荧光强度大约是印迹上荧光强度的两倍）在染色之前轻轻混合细胞，并在放入流式细胞仪中运行之前使用移液管再次轻轻混合细胞；也可以筛选或过滤细胞，以除去团块（30ul尼龙网）

问题五：高事件率

1. 细胞数量过多

建议：细胞数量稀释至1x10'至1x106个细胞/ml

问题六：低事件率

1. 每毫升的细胞数过少
建议：运行浓度应为1x106个细胞/ml，并确保细胞混合均匀（轻柔混匀）

2. 细胞聚集，阻塞管道
建议：染色前通过轻轻吸移几次，确保得到同源单细胞悬液，上机前再次混匀；极端情况下，可以筛选或过滤细胞，以去除团块（30ul尼龙网）

问题七：侧向散射背景偏高（来自小颗粒）

1. 细胞裂解
建议：确保样本中的细胞没有裂解和破碎；样本应新鲜，且制备正确；不要在高转速或激烈涡旋的情况下对细胞进行离心

2. 细菌污染

建议：确保样本不受污染；细菌会自动发出低水平荧光，这也会造成高事件率

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