细胞衰老模型建立实验流程

一、实验材料准备

1. 细胞系：选择易于培养且具有明确衰老特征的细胞，如人胚肺成纤维细胞（MRC-5）、HEK293、HUVEC等。

2. 试剂：

- 基础培养基（如DMEM、MEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素双抗。

- 衰老诱导试剂：

- 复制性衰老：持续传代培养。

- 药物诱导衰老：D-半乳糖（100-500 mM）、阿霉素（0.1-1 μM）、H₂O₂（100-500 μM）等。

- 检测试剂：

- β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色试剂盒

- 细胞周期蛋白（如p16、p21）抗体及Western blot相关试剂

- 活性氧（ROS）检测试剂盒（DCFH-DA）

- 衰老相关分泌表型（SASP）检测试剂盒（ELISA或qPCR检测IL-6、IL-8等）

3. 耗材与仪器：

- 细胞培养瓶、6/12/24孔板、移液枪、离心机、倒置显微镜、CO₂培养箱、酶标仪、Western blot设备。

二、细胞培养与处理

1. 细胞复苏与培养

- 将冻存细胞快速复苏（37℃水浴），转入含10% FBS和1%双抗的培养基，37℃、5% CO₂培养箱中培养。

- 待细胞密度达80%-90%时，用0.25%胰酶消化传代。

2. 复制性衰老模型建立

- 持续传代培养细胞，记录传代次数（如P10-P30）。

- 当细胞出现生长停滞、形态扁平增大、增殖速率显著下降时，视为进入衰老阶段（通常在高代次，如P25+）。

3. 药物诱导衰老模型建立

- D-半乳糖诱导：在培养基中加入100-500 mM D-半乳糖，处理3-7天。

- 阿霉素诱导：加入0.1-1 μM阿霉素，处理24-48小时后更换新鲜培养基继续培养2-3天。

- H₂O₂诱导：加入100-500 μM H₂O₂，处理1-3小时后更换新鲜培养基。

三、细胞衰老鉴定

1. SA-β-gal染色

- 收集细胞，PBS洗涤后，加入SA-β-gal染色液，37℃避光孵育12-16小时。

- 显微镜下观察，衰老细胞呈现蓝色颗粒，统计阳性细胞比例（≥30%为衰老模型成功）。

2. 细胞周期蛋白检测

- Western blot：提取细胞总蛋白，检测p16、p21等衰老标志物表达水平。

- qPCR：检测p16、p21 mRNA表达变化。

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