1、CCK-8基本概念

CCK-8: （Cell Counting Kit-8），是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。

基本原理：CCK-8试剂中含有WST-8，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

2、CCK-8实验用途

• 药物筛选

• 细胞增殖测定

• 细胞毒性测定

• 肿瘤药敏实验

3、CCK-8优缺点

优点：

• 产生的甲瓒产物是水溶性的，无需换液，适合悬浮细胞

• 不需要放射性同位素和有机溶剂，对细胞的毒性小

• CCK-8细胞活性检测试剂毋需预制，即开即用

• 灵敏度高，线性范围宽，数据可靠，重现性好

• 操作简便，省时省力

• 适合于高通量药物筛选

缺点

• 与MTT法相比，CCK-8的价格比较贵

• CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，操作过程中容易漏加或多加

4、CCK-8与MTT的区别

5、CCK-8实验步骤

1）在96孔板中每孔加入100μl的细胞悬液。

2）在培养箱中预培养细胞

3）向培养板中加入药物，如果不加药，可直接进行第5步操作

4）在培养箱中培养一段时间

5）向每孔加入10μlCCK-8溶液

6）在培育箱中培养1-4小时(司根据自己的实验情况调整时间)

7）用酶标仅测定在450nm处的吸光度

6、CCK-8实验注意事项以及常见问题

注意事项:

1、细胞悬液加入96孔板前，应充分混匀，以免每孔加入细胞量不相等;

2、96 孔板周围一圈液体容易蒸发，应当加入等量的PBS 或培养基，以缓解蒸发;

3、CCK-8 的培养时间一般为1~4h，重复实验必须保证相同培养时间;

4、CCK-8试剂颜色与培养基颜色几乎相同，必须集中注意力加入，以免漏加;

5、酶标仪检测吸光度时，震荡时间不能少于15s，以免孔内试剂颜色不匀。

常见问题:

在加入 CCK-8 时可否不更换培养基?

答:一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话，有可能会产生误差，必须更换其它培养基。

CCK-8会对活细胞进行染色吗?

答:不会，首先WST-8不会进入细胞染色，整个显色反应都是在培养体系中进行的。另外WST-8甲臜都属于高度水溶性组分，反应结束更换新的培养液，即可清除外源组分。

7、CCK-8实验设计及计算

1）空白组（绿色）:培养基;

2）对照组（粉色）:培养基+细胞+PBS;

3）实验组（红色）:培养基+细胞+待测样品;

4）白色孔加入100ulPBS或培养基，以缓解蒸发。

空白孔（不含细胞和待测物质的培养基，含有CCK-8）

对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8，不含有待测物质）

实验孔（含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质）

计算公式：

细胞存活率=[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]x 100%

抑制率 =[(对照孔-实验孔) /(对照孔-空白孔)]x100%

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