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病理学技术（组织标本切片和染色技术）是组织学、病理学等学科用于观察和研究组织与细胞的正常形态及病理变化的常用方法。组织经过固定、切片和染色后，在显微镜下能清晰观察其组织结构。
今天，就带领大家了解一下病理实验全流程的详细步骤吧~
一、取材 1.组织选择：在进行取材时，选择代表性强的组织区域至关重要。这一选择依赖于对病变部位的精确判断，确保所取样本能够反映病理状态或研究需求。 2.组织处理：取材后，组织需立即用适当的固定剂（通常是福尔马林）固定。固定时间依赖于组织的大小和密度，一般推荐24~48小时，以确保组织的结构和分子完整性。 二、包埋 1.脱水：固定后的组织首先需经过一系列浓度递增的酒精溶液脱水，以去除组织中的水分。 2.透明：随后使用如二甲苯等透明剂，使组织透明化，为浸蜡做准备。 3.浸蜡：完全脱水和透明化后，组织被浸入熔融的石蜡中，石蜡在冷却后形成坚固的包埋块，使组织固定在所需的方向，便于后续的切片制作。 三、切片 1.技术要点 切片厚度选择：从包埋块中切取薄片时，通常选择4~5微米厚度，这一厚度最适合大多数染色技术，确保细胞结构的清晰可见而不会产生重叠影响。 微切片技术：使用显微切片机平稳操作，保证切片的均匀和连续。 2.切片处理 烘干：将切片放置在滑片上，通常在37℃下烘干数小时，有时过夜，以固定组织在滑片上。 脱蜡：为了去除石蜡并使组织准备好染色，切片需要在二甲苯中处理，随后用系列浓度的酒精进行水化处理。 四、染色（以HE染色为例） 1.试剂配制 固定液：10%甲醛溶液； 苏木精染液：称取苏木精粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取31g的NaIO，5ml水，再加入30ml甘油和2ml冰醋酸，混合均匀，滤纸过滤，备用； 伊红染液：称取0.5g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中； 稀盐酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1%盐酸； 系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。 2.实验步骤 ①石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min-->二甲苯Ⅱ10min-->无水乙醇Ⅰ5min-->无水乙醇Ⅱ5min-->95%酒精5min-->95%酒精5min-->80%酒精5min-->自来水冲洗。 ②苏木素染细胞核：切片放入苏木素染3~8min，自来水冲洗，接着用1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，最后用0.6%氨水返蓝，流水冲洗。 ③伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1~3min。 ④脱水封片：将切片依次放入95%酒精Ⅰ5min-->95%酒精Ⅱ5min-->无水乙醇Ⅰ5min-->无水乙醇Ⅱ5min-->二甲苯Ⅰ5min-->二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。 ⑤显微镜镜检，图像采集分析：细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色，细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色，胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。 3.常见染色方法 ①HE染色 【应用】HE染色是最常用的组织学染色方法，可以用于观察组织结构、细胞形态和核染色质等。可用于病理诊断、评估组织损伤程度以及确定肿瘤类型等。 【结果判断】细胞核呈蓝色或紫色，细胞质和其他组织结构呈粉红色。 【样本检测】固定的组织切片，如肿瘤组织、器官组织等。 【优缺点】简单易行，可以提供关于细胞形态学和组织结构的信息。缺点是不能提供特定蛋白质或其他分子的信息。 ②Masson染色 【应用】Masson染色用于观察胶原纤维的分布和形态，常用于研究纤维组织增生、纤维化和肉芽肿等病理过程。 【结果判断】胶原纤维染蓝色，细胞核和其他组织结构染不同颜色，如细胞核呈黑色，肌红维呈红色。 【样本检测】固定的组织切片或细胞涂片，用于检测特定抗原，可以提供关于纤维组织变化的信息。然而，结果可能受到染色剂选择和操作技术的影响或分子的表达和定位。 【优缺点】染色效果清晰，能够清晰地显示组织中的纤维结构，且染色稳定，染色剂种类多。缺点是染色时间难以控制，且高质量染色剂成本可能较高。 ③PAS染色 【应用】PAS糖原染色用于检测组织或细胞中的糖原含量和分布情况。常用于评估肝脏、肾脏、肌肉等器官的糖原沉积和代谢异常。 【结果判断】糖原呈紫色或洋红色，细胞核和其他组织结构呈不同颜色，如细胞核呈蓝色。 【样本检测】适用于检测组织中的糖原含量和分布，如肝脏、胰腺等。 【优缺点】可以提供关于组织中糖原含量和分布的信息，对于研究糖代谢异常和肝脏疾病等具有重要意义。然而，该方法不能区分不同类型的多糖。 ④天狼星红染色 【应用】天狼猩红染色主要用于染色骨髓涂片和神经组织切片，主要应用于评估铁过载病理、肝脏疾病等，以观察细胞核、细胞质、髓鞘等结构。 【结果判断】使用天狼猩红作为染色剂，它可以与铁离子结合形成染色复合物，细胞核呈蓝色，细胞质和髓鞘呈红色或粉红色。 【样本检测】常用于神经组织或骨髓涂片的染色。 【优缺点】可以提供关于组织中铁离子沉积的信息，对于诊断铁过载疾病具有重要意义。然而，该方法不能区分不同类型的铁沉积。 ⑤弹力纤维染色 【应用】弹力纤维染色用于区别正常的动脉和静脉，观察各种疾病对弹力纤维的影响及变化，可用于多种疾病的诊断，例如弹力纤维性假黄瘤、心血管疾病、一系列呼吸系统疾病、肺癌等。 【结果判断】弹力纤维呈蓝黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维红细胞呈黄色。 【样本检测】适用于检测观察皮肤组织中弹力纤维的变化情况。 【优缺点】染色快，操作简便，染色保存久，粗大的弹力纤维染色效果良好，但对纤细纤维效果欠佳。 ⑥尼氏染色 【应用】尼氏染色能够有效染显尼氏体，从而观察神经元内的细胞结构，并通过对尼氏体的观察来评估神经元是否受损，更全面地了解神经元的结构和状态。 【结果判断】焦油紫作为染色剂，尼氏体呈紫色、细胞核呈淡紫色。 【样本检测】适用于检测不同神经元中的尼氏体形状、大小和数量。 【优缺点】尼氏染色在观察时能够提供更为清晰可辨的图像，使尼氏体、轴突和树突更容易区分。但神经元受损时，尼氏体的数量可能减少甚至消失，便不能获得高质量清晰染色图像。 4.各类组织常见染色方法及指标 ①脑 【常做特殊染色/常做组化荧光指标】TTC（脑梗），尼氏染色，甘安银染色，LFB染色，高尔基染色，刚果红染色，FJB染色。 ②心脏 【常做特殊染色/常做组化荧光指标】TTC（心梗），mason（心梗），天狼猩红（心梗），冰切油红（动脉粥样硬化，主动脉瓣）。 ③主动脉 【常做特殊染色】EVG，大体油红，冰切油红，movant五色法。 【常做组化荧光指标】a-SMA，VWF，VII，VEGF。 ④肝 【常做特殊染色】PAS染色，冰切油红，mason，天狼猩红。 【常做组化荧光指标】炎症：CD3，CD4，CD8，CD68，F4/80，MPOLy6G，CD11c，CD11b，IL2，IL4，IL6，IL8，IL10，TGFb，Tonfa；纤维化：Tonfa-SMA，FN，LN。 ⑤肾 【常做特殊染色】PAS染色，PASM染色，mason，天狼猩红。 【常做组化荧光指标】纤维化：Tonfa-SMA，FN，LN。 ⑥肺 【常做特殊染色】HE染色，PAS染色，mason，天狼猩红，Wiegert间苯二酚碱性品红染色。 【常做组化荧光指标】炎症：CD3，CD4，CD8，CD68，F4/80，MPO，Ly6G，CD11c，CD11b，IL2，IL4，IL6，IL8，IL10，TGFb，Tonfa；纤维化：Tonfa-SMA，FN，LN。 ⑦胃 【常做特殊染色】HE染色，PAS染色，阿利新蓝染色，AB-PAS染色，肥大细胞染色。 【常做组化荧光指标】c-kit，GLP-1，Z0-1，claudin，occluding。 ⑧肠 【常做特殊染色】HE染色，PAS染色，阿利新蓝染色，AB-PAS染色，肥大细胞染色。 【常做组化荧光指标】ic-kit，GLP-1，Z0-1，claudin，occluding。 每种染色方法都有其优点和限制，需要根据具体需求选择合适的方法，并注意控制实验条件以获得可靠的结果。
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