在描述不同情况下，细胞之间的荧光强度变化时，通常会将两者作一个比值，得到荧光比率图，从而可以直观地观察到空间上的变化情况：

编辑搜图

这篇文章会讲解怎样利用ImageJ做荧光比率图。

以FRET(Fluorescence resonance energy transfer)图像为例，通过将FRET图像(YFP)与Donor图像(CFP)作比值，可以观察蛋白之间相互作用的位置：

编辑搜图

一、去除背景

首先去除目标信号以外的背景，这一步本质是将细胞与背景分割开来

1、利用运用Threshold选中细胞（Image -> Adjust -> Threshold）

2、得到选取区（Edit -> Selection -> Create Selection）

并且将该选取区Add到ROI Manager当中

3、清除选取区之外的信号（Edit -> Clear Outside）

在两个channel的原图上选中该ROI，然后清除选取区之外的信号，即背景：

二、计算比值

利用Image Calculator计算两张图的比值（Process -> Image Calculator）：

从而得到比率图：

在做除法时，不可避免会遇到分母是0的情况，这会导致图像出现很多异常值。

这些异常值通常为NaN、Infinity或者一些特别大的值。

三、添加伪彩与Calibration Bar

1、添加伪彩（Image -> Lookup Tables -> Spectrum）

这里添加Spectrum样式的伪彩，可以适当调节对比度（Image -> Adjust -> Brightness/Contrast）

2、生成Calibration bar（Analyze -> Tools -> Calibration Bar）

这里Calibration bar可以不直接添加到图像上，可以单独生成，然后在Figure排版时添加：

3、将比率图转为RGB格式（Image -> Type -> RGB color）

转为RGB后，如果背景想要是黑色，可以重复（Edit -> Clear Outside）去掉背景这一步骤，这里需要注意后景色需要是黑色：

将比率图转为RGB格式（Image -> Type -> RGB color）

转为RGB后，后景色调成黑色，选中ROI，去掉背景（Edit -> Clear Outside）

最后得到：

通过该图像配合Calibration Bar，即可蛋白相互作用的区域进行定位。

实验外包    想了解更多请关注：http://www.do-gene.cn