免疫组化结果如何分析？手动计数经常2遍结果不一致？经常数到头昏眼花？这一篇Image J分析免疫组化结果的教程它来啦！从软件安装到操作步骤的干货全教给你，新手也能 10 分钟上手。

使用FIJI分析免疫组化结果通常有两种，一种是直接分析，一种是用插件分析，本期咱们讲第一种。

1.打开图像

通过File → Open打开图像或把图像拖到软件上

2.图像去卷积

Why：可以提高图像质量，从而获得更可靠、更详细的信息，便于后续分析和展示

How：选择Image → Color → Color Deconvolution-H DAB。（保留colour_2，其他关掉)

注意：Fiji集成了 Color Deconvolution，Image J则需要另外安装，需要安装方法的可评论区留言。

3.灰度值转换光密度值

灰度值

定义： 数字图像中单个像素的亮度或强度值。它表示该像素位置接收到的光信号的相对强度（对于相机或扫描仪等探测器而言）。

在8-bit 图像： 0 (纯黑) 到 255 (纯白)，0 代表探测器在该位置检测到的光信号最弱（或无信号，即最暗/黑）。最大值（如 255）代表探测器在该位置检测到的光信号最强（或饱和，即最亮/白）。

OD值（光密度值）

定义： 表示透射过样品某一点的光被吸收的程度。它是一个物理量，描述样品本身对光的衰减能力。

OD值的范围从连续实数 (0 到 +∞)，0值表示无吸收/完全透明 ，最大值表示无限吸收/完全不透明。

免疫组化为什么要转换下呢？

如果用灰度来统计，纯白背景的数值为255，DAB着色越深，数值反而越小，这个和我们的认知相反。如果以光密度值来分析，背景纯白的值接近于0，DAB着色越深，OD值越大，这样更符合实际情况。

How：Analyze→Calibrate→拉到底部Uncalibrated OD→OK

4.调整阈值

Why：手动调整使阳性染色区域更贴近实际情况

How：：Image → Adjust → Threshold，左右拉动进度条调整到满意为止

5.设置测量参数

Why：告诉软件测量哪些参数

How：：Analyze → Set Measurements，选择需要测量的参数

6.测量结果

How：Analyze → Measure

7.结果解读

Area：区域覆盖的面积

Mean：区域平均OD值

Min：区域最小OD值

Max：区域最大OD值

RawIntDen：区域总灰度值

IntDen（Integratedoption density，IOD）：累积光密度值，即阳性区域内所有像素的光密度值之和

%Area：阳性面积百分比，（选中区域内的阳性面积 ÷ 选中区域的总面积）× 100%

AOD（AverageOptical Density）：平均光密度值，是累积光密度值（IOD）与阳性区域面积的比值,公式：平均光密度值 = IOD / 阳性区域面积

AOD和%Area区别

• %Area计算 “面积占比”，它只关注 “阳性区域占了多少地方”，不关心这些区域的染色是深是浅 —— 哪怕阳性区染色很淡（接近背景色），只要被判定为 “阳性”，就会被计入面积。它反映的是阳性信号的“分布范围”——比如，模型组中BDNF的阳性染色面积比正常组大4倍，说明阳性信号的扩散范围更广。

• AOD计算 “光信号强度”，因此，平均光密度值反映的是阳性信号的“平均强度”——比如，模型组中BDNF的阳性区域平均光密度值比正常组高1倍，说明每个阳性像素的染色更深，蛋白表达量可能更高。

• 生物学意义：一个说 “有多少细胞阳性”，一个说 “阳性细胞表达有多强”。

• 如果你关注的是“阳性信号覆盖了多少区域”（比如，炎症细胞的浸润范围、血管的新生范围），选**%Area**；

• 如果你关注的是“阳性信号的强弱”（比如，蛋白的表达量、受体的密度），选平均光密度值。
  

正确解读案例

某研究用免疫组化检测大脑中动脉阻塞（MCAO）模型大鼠脑皮质中BDNF的表达，结果如下：

解读：

• %Area升高（5.2%→21.8%）：说明模型组中BDNF的阳性染色面积比正常组大，即阳性信号的“分布范围”更广（比如，原本只有少量神经元表达BDNF，现在更多神经元甚至胶质细胞都表达了）。

• 平均光密度值升高（0.15→0.28）：说明模型组中每个阳性像素的染色更深，即阳性信号的“强度”更高（比如，原本每个表达BDNF的神经元染色较浅，现在染色更深）。
  

错误解读案例

有同学研究 “药物对某蛋白的调控作用”，只测了 % Area—— 发现用药组和对照组的 % Area 都是 30%，就得出 “药物无作用” 的结论。但其实若测了 AOD，可能发现用药组的 AOD 从 2.5 降到 1.2（染色变浅），说明药物虽然没减少阳性细胞数量，却降低了蛋白表达强度，结论完全不同。

总结

• 研究阳性信号的“分布范围”选%Area，比如：炎症细胞浸润范围、血管新生范围、阳性细胞数量比率（如Ki67、CD3）。

• 研究阳性信号的“平均强度”，比如：蛋白表达量（如BDNF、VEGF）、受体密度、染色深浅；

• 在实际研究中，%Area与平均光密度值结合使用，才能全面反映免疫组化结果的“量”（分布范围）与“质”（信号强度）。很多期刊也要求 “完整呈现免疫组化分析数据”，单独给 % Area 或 AOD 可能被审稿人质疑 “数据不完整”，两者结合能让结论更可信。

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