一、构建重组质粒的步骤：

第三步：将空载体和目的基因连接起来，即重组质粒。

二、构建重组质粒详细操作步骤：

打开snapgene软件，在snapgene中打开上述空载体文件，可以直接看到质粒载体图谱详细信息，具体查看方式可以参考复习笔记15：质粒和质粒图谱相关内容。

3.选择目的基因和载体酶切位点

选择的标准：目的基因上没有而载体上有的酶切位点；载体上酶切位点只有一个。突出序列选择“粘性末端”。比如选择NcoI和XbaI酶切位点，保存文件。（注意两个酶切位点距离，文中两个酶切位点只供参考）

同理，打开snapgene软件，新建DNA文件，将基因序列粘贴到空白框中，命名。确定之后就可以看到目的基因序列。

先进行引物设计，在引物中插入与载体相同的酶切位点。

点击“action”、“聚合酶链式反应”，对基因进行扩增，将上述设计好的引物添加到相应的位置，点击“聚合酶链式反应PCR”。

下面就是用设计好的引物扩增出来的PCR片段，保存文件。

点击菜单栏“工具”、“序列比对”，比对扩增后和扩增前DNA序列。

结果表明，两个DNA序列完全相同，说明设计的引物没有问题。保存“123扩增”文件。

5.将空载体和目的基因连接起来，即重组质粒。

点击“123克隆”，重新命名为“pET28a-123”。

点击“特征”、“添加特征”，将特征改为“123”，颜色改为“绿色”，确定。绿色区域即为插入的目的基因。

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