原核表达

1.将构建好的载体转入BL21（DE3）表达菌株中（表达菌株有不同种类，现了解到有Rosetta（DE3）菌株，具有稀有密码子）

2.挑取单克隆菌置入20ml抗性培养基中37℃过夜培养

3.按1：100的比例加入液体LB培养基中，37℃，200rpm培养3h，至终浓度1.0

4.放入4℃冷却10min左右，加入IPTG诱导，终浓度为（0.1-1.0mM之间），16-37℃诱导，2-24h，100-200rpm。

PS:假如蛋白较大（>80Kda），易形成包涵体，则选择将IPTG浓度降低，诱导温度降低，诱导时间增长，转速降低。

细胞破碎（小量用超声破碎，大量用超高压微射流细胞破碎仪）

1.用4℃，6000r/min离心10min收集菌体，弃上清，用 buffer重悬。PS:①超声破碎菌体重悬浓度5-10%左右即可，一般50ml LB过夜诱导培养后重量为0.5g左右,用5-10ml buffer重悬。②超高压破碎重悬浓度为20%左右，一般1L LB过夜诱导培养后重量为10-15g，用50ml Buffer重悬。

2.用超声波细胞破碎仪低温破碎菌体，功率30%（600w），破碎3s，暂停5s，每运行2min暂停2min，破碎至溶液澄清，小量破碎超声时间1min左右即可。

3.用低温超高压微射流细胞破碎仪（JN-02C）破碎菌体，①将水灌满至没过高压缸体，然后打开压缩机将水温降低至4℃，同时在低压条件下用单蒸水洗涤缸体2次，然后用buffer洗涤缸体2次。②将缸压加至1000bar，将菌体加入，破碎3次至菌体澄清。③用buffer洗，再用单蒸水洗2次，再加入20%的乙醇洗一次，留一定量的20%的乙醇封闭。④用完后将压力阀松开泄压，将缸外水排空。PS：若出液口长时间不出液，则是缸体进入气泡导致，可用钢针戳几次进样口将空气排空。菌体重悬后不可有块状物体，否则会堵塞仪器。

4.用4℃ 10000rpm离心10-45min，收集上清液PS:用于检测，离心10min即可，用于纯化则需离心更长时间。

5.使用滤膜过滤上清备用。

蛋白纯化

原则：1.用烧剪过的枪头吸取琼脂糖填料，使用预装柱比用Beads孵育效果要好一些，一般纯化1L LB诱导的上清使用3ml填料足够（载量在25mg-40mg之间，一般诱导不出这么多蛋白）

2.所有使用的buffer都需要使用滤膜过滤，以免堵塞填料，所有填料一般使用5次后需要重生，使用0.1M的NaOH洗涤，然后用buffer平衡，再用20%保存。PS:滤膜使用原则：无机溶剂为主的buffer用水膜过滤，有机溶剂为主的buffer用有机膜过滤。

3.洗杂时用考马斯亮蓝G250检测蛋白（90ulG250+10ul蛋白液），洗杂至G250不变蓝为止。

4.洗脱时每隔1ml接一滴洗脱液，检测到不到蓝色为止。

5.收集上清液，流穿液，洗杂液，洗脱液跑PAGE胶，检测纯化效果。

6.脱盐柱脱盐或者超滤离心或者透析置换。（含10%的甘油的缓冲液，可-80℃储存）

试剂配方：各种buffer

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