现在有很多设备名字中都带着“共聚焦”或者“共焦”的字眼，但实际原理和应用却千差万别。

比如下方几种设备名称各异，但都含有“共聚焦”的意思，一时之间让人摸不着头脑。

• 激光共聚焦显微镜

• 激光扫描共聚焦显微镜

• 点光谱共聚焦传感器

• 线光谱共焦传感器

• 白光干涉显微镜

• 白光扫描共焦显微镜

下面就分别讲一下上述几种设备的原理和区别，以下的信息（图片）是笔者精心搜集和筛选的，对于理解其原理非常有帮助。

激光共聚焦显微镜，这个称呼等价于激光扫描共聚焦显微镜，它们都属于荧光显微镜的一种。

激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM），通过一种或多种荧光探针标记研究对象，在荧光显微镜基础上配置激光扫描装置，采用共轭聚焦方式，对观察样品进行逐点扫描，实现高分辨的共聚焦图像，进一步的，通过控制Z轴焦平面，可实现三维成像。

如下图所示，样品被激光激发后的出射光波长比入射光长，可通过分光镜，经过透镜再次聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测到，并在显示器上成像，得到所需的荧光图像。与此同时，而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡，不能通过探测针孔，因而不能在显示器上显出荧光信号。这种双共轭成像方式称为共聚焦。因采用激光作为光源，故称之为“激光扫描共聚焦显微镜”。

激光扫描共聚焦显微镜通过对样品X-Y轴的逐点扫描，形成二维图像。如果在z轴上调节聚焦平面的位置，连续扫描多个不同位置的二维图像，则可获得一系列的光学切片图像。在相应软件的支持下，通过数字去卷积方法(deconvolution)得到清晰的三维重建图像。正因为激光扫描共聚焦显微镜能沿着z轴方向在不同层面上获得该层的光学切片，所以可以得到组织细胞各个横断面的一系列连续光学切片，实现细胞“CT”功能。

关键信息如下：

• 该结构只适用于荧光显微镜；

• 普通面光源激发荧光产生的图像很模糊；

• 汇聚激光激发出的荧光范围小，成像锐；

• 两个小孔构成双共轭结构，即：共聚焦；

• 代价是：每次只成像一个点，需扫描，因此称为激光扫描共聚焦显微镜。

激光扫描显微镜之所以能够产生如此高质量的图像，是因为它们能够有效地通过共聚焦针孔抑制离焦荧光，从而使探测器一次只能采集一个聚焦的点。正因为如此，采集样品的完整3D图像可能需要很长时间。

技术上的进步加速了激光扫描显微镜的逐点收集能力，旋转圆盘的引入就是一个例子，如下图所示。转盘共聚焦显微镜与用于阻挡离焦荧光的针孔数量有关。虽然共聚焦激光扫描显微镜使用单个针孔，但转盘共聚焦显微镜使用的是拥有数百个针孔并可以高速旋转的不透明圆盘。因此一次扫描即可对整个样品进行成像，而不是逐点成像。这也有助于减少光损伤和光漂白。

一般来说，共焦显微镜包含多个用于荧光颜色通道（红色、绿色和蓝色等；每个都有单独的针孔孔径）的光电倍增管，用于区分荧光团，以及用于透射或反射光成像的光电倍增管。下图给出了CLSM600激光扫描共聚焦显微镜的激光光源部分的原理示意图。

下图是对应的CLSM600激光扫描共聚焦显微镜实物图。

激光扫描共聚焦显微镜具有比传统荧光显微镜更高的分辨率，而且可三维成像，实现样品内部结构清晰成像，在细胞的三维重建、细胞原位检测核酸、基因测序等生物科学中广泛应用。下图给出了同样的被测样品，普通荧光显微镜和激光共焦显微镜下的观察效果对比，可以看出，激光共焦显微镜在成像细节和清晰度方面具有显著优势。

二、光谱共聚焦传感器

注意，“传感器”和“显微镜”的区别：只能用来测量却不可以成像的设备，我们称为传感器，而反之只要可以显微成像的设备我们都称之为显微镜。即便有些显微镜也同时兼具测量的能力，我们仍然习惯称之为“显微镜”，例如“白光干涉显微镜”。

光谱共聚焦传感器，实际上有两大类，分别是：点光谱共聚焦位移传感器，以及线光谱共聚焦轮廓传感器。

（一）点光谱共聚焦位移传感器

光谱共焦位移传感器是一种通过光学色散原理建立距离与波长间的对应关系，利用光谱仪解码光谱信息，从而获得位置信息的装置。其原理如下图所示。

下图给出了设备的结构布局，白光LED 光源发出的光通过光纤耦合器后可以近似看作点光源，经过准直和色散物镜聚焦后发生光谱色散，在光轴上形成连续的单色光焦点，且每一个单色光焦点到被测物体的距离都不同。当被测物处于测量范围内某一位置时，只有某一波长的光聚焦在被测面上，该波长的光由于满足共焦条件，可以从被测物表面反射回光纤耦合器并进入光谱仪，而其他波长的光在被测物面表面处于离焦状态，反射回的光在光源处的分布远大于光纤纤芯直径，所以大部分光线无法进入光谱仪。通过光谱仪解码得到光强最大处的波长值，从而测得目标对应的距离值。

（二）线光谱共聚焦轮廓传感器

点光谱共聚焦仅能测量单点位置，面测量则需要二维扫描，效率太低。为此发展了线光谱共聚焦传感器，面测量只需要扫描一个方向。该技术采用狭缝光源或柱透镜产生线光源，通过色散棱镜色散，采用接收狭缝配合光谱仪测量，如下图所示。

线光谱共聚焦轮廓传感器有两种光学布局方案：同轴式和对射式。

1. 同轴式：工作原理和光路与点光谱共聚焦传感器类似，只是使用了狭缝光源或柱透镜产生线光源，采用接收狭缝配合光谱仪进行测量。

2. 对射式：光源与接收器分离，对称分布。如下图所示。

下图为对射式线光谱共聚焦轮廓传感器工作演示和测量效果

三、白光干涉显微镜

它既是显微镜又是传感器，其测量方法基于麦克尔逊干涉原理，其光学配置包含有μm 范围内相干长度的光源，原理如下图所示。准直光束在光束分离器上被分成测量光束和参考光束。测量光束照射样品，参考光束照射一面镜子。镜子和样品上反射的光在分束器处重新合并后聚焦到相机上。现在多使用Mirau干涉物镜而取消了参考臂的镜子，具有更好的稳定性。Mirau物镜（或样品）由沿光轴的精密级驱动。在其垂直运动过程中，会检测到传感器中每个像素的反射光的强度。干涉图中的最大强度调制发生在距离测量对象的距离（光束路径）等于距离参考表面（镜面）的距离的位置。通过计算这个最大值来得到每个点的高度数据。最后，根据高度数据和相应的横向坐标，给出了样品的地形图。

白光干涉的结构示意图如下所示：

下图给出了白光干涉测量的实际效果。

使用白光干涉测量法（相干扫描干涉测量法）进行平面测量时，垂直分辨率并不取决于所选的物镜。白光干涉测量法是唯一一种垂直分辨率与视场无关的测量方法（当然，水平分辨率仍然和视场有关）。

关于“白光扫描共焦显微镜”的说法，很少见，它等价于“白光干涉显微镜”。

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