ELISA实验步骤少，流程短，购买的ELISA试剂盒也都有指导性很强的操作说明书，单次实验3-6小时即可得到结果，实验小白也可以很快的上手。

但是，各位同学可不要这样就轻视哦~，ELISA和WB、IHC等基础免疫实验一样，都是易学难精，上手容易，但想要得到稳定的结果，不好好做些准备可是不行的哦~

夹心法ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么？

不是的，在双抗夹心法ELISA实验中，会同时用到捕获抗体和检测抗体，这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体，这样才可以同时结合抗原分子。这也是双抗夹心法ELISA不适用与小分子抗原和半抗原等待测指标的原因。

最后显示的OD值在多少之间属于可用值，有要求吗？

有的，建议标准曲线最高浓度点的OD值在2.0左右较好，也可参考说明书标曲的数据。

标准曲线在推荐的浓度下，r2值为0.9，做了多次都是这样，怎么办？

这种情况首先要仔细核对产品说明书，看是否用了推荐的拟合方法，如拟合方式无误，需检查是否有个别标曲孔数值异常，排查实验过程中是否出现污染或标准品倍比稀释时出现失误，导致加样不准。

副孔差别比较大，是没洗干净吗？

复孔值差异较大，主要原因应考虑加样是否准确，洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。加样应注意移液器量程，以及枪头残留问题；洗板过程应注意不要有残留液体，需要进行拍干操作；孵育过程要更换封板膜，拍干过程要换吸水纸，避免交叉污染。

ELISA可以检测胞内蛋白么？

可以的，大部分ELISA指标均为炎症因子、趋化因子等分泌类型蛋白，支持的样本类型也多为血清、血浆、细胞培养上清等液体样本。如需检测胞内蛋白，首先需要确认待测指标是否在胞内表达，然后选用支持组织匀浆样本的ELISA试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，保证每孔上样总蛋白量一致即可。

同一样品多次ELISA检测，测试结果差异大怎么解决？

应考虑的问题包括：

• 样本保存不当，会导致多次实验结果偏差较大，样本应尽量减少反复冻融，如需多次检测，需在取样后分装保存；

• 样品冻融之后未混匀，应混匀后再上样；

• 加样不准确，微量样品加样时要注意移液器枪头不要有残留。

检测样本是细胞培养上清，那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗？

有影响，所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。因不同处理，可能会导致细胞生产状态不同，要保证在铺板时接种细胞数量水平一致。

整个过程需要避光吗？避光需要避到什么程度呢？

ELISA实验中，在酶标抗体孵育，以及显色底物孵育这两步建议避光，其他步骤无需避光。避光可采用封板膜覆盖，或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。

封板膜什么时候用？每次加液后都要换吗？

封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体时，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。

ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机，需要如何操作？

实验室ELISA实验做的较多，还是建议使用洗板机洗板，效果更好，也更方便控制。如果没有洗板机，在洗板过程中，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置1-2min，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。

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