一、 实验材料：

1. BrdU (5-溴代-脱氧尿苷) (Sigma Catalog No.B-5002)

2. RNase A (Sigma Catalog No. R4642)

3. Tween 20 (Fisher Biotech BP337-500)

4. Triton X-100 (Sigma Catalog No. T9284)

5. BSA (Sigma Catalog No. A 3803)

6. 碘化丙啶 (Sigma Catalog No. P-4170)

7. anti-BrdU (Sigma Catalog No. B 2531)

8. 羊抗鼠二抗 (全分子) FITC 接合的 (Sigma Catalog No.F 0257)

9. HCl

10. 四硼酸钠 (Na2B4O7 ·10H2O) (Sigma Catalog No. B 9876)

11. 0.05 %胰蛋白酶-EDTA (GIBCO, Catalog No.25300-062)

12. 乙醇

二、 实验仪器：

显微镜: Leica H1210    二氧化碳培养箱: Thermo

水浴锅   烘箱

三、 实验步骤：

a) 在最适的环境下培养细胞 (细胞密度在临界对数生长期)加入 BrdU至终浓度为 30 μM. 孵育 30-60分钟.

注意: BrdU是光敏型，所以必须在黑暗中加入（细胞加了BrdU以后也可能光敏感—因此也在黑暗中培养）。加入BrdU的时间和浓度根据细胞的类型和复制时间来确定，范围在15分钟到2个小时，浓度从10 μM到100 μM ，例如我们处理鼠胚胎成纤维细胞为30 μM 处理60min。

b) 除去 BrdU. 用 PBS洗一次。.

c) 可渗透化处理细胞: 用0.3 ml PBS轻轻的洗涤细胞, 然后慢慢加入0.7 ml 预冷的100%乙醇。轻轻混匀。在4 °C 至少静置1 h。

注意: 可渗透化处理细胞后细胞样品可以4 °C储存于乙醇中2个星期。

d) PBS洗涤3次并且移去上清。

e) 加入 0.5 ml 2 N HCl/0.5% Triton X-100 室温孵育 30 min。

f) PBS洗涤3次并且移去上清，加入0.5 ml 0.1 M四硼酸钠处理细胞2 min。

g) 用PBS/ 1 % BSA洗细胞一次

h) 用0.5% Tween-20/1%BSA/PBS混合10-20 μl (1 μg/106 cells) anti-BrdU，加入孔板，在室温下避光孵育一个小时。

i) PBS/ 1 % BSA洗一次。

j) 0.5% Tween-20/1%BSA/PBS混合5 μl (1 μg/106 cells) 羊抗鼠二抗-FITC（根据BrdU的种属选择），室温下避光孵育30分钟。

k)  去上清，加入50ug/ml的RNASE A 室温孵育30分钟后加入含有20 μg/ml  碘化丙啶(PI 母液) 的0.5 ml PBS 重悬细胞（RNASE A步骤可略），避光室温孵育半个小时。

l) 另设置对照1. 只用 PI 染细胞.；2. Cells没有加 BrdU, 只加抗体

各种试剂配置方法

1.   0.1 M四硼酸钠, pH 8.5

2.  2N HCl/0.5 % Trition X-100: 0.05 ml Trition X-100, 1.67 ml HCl加到8.28 ml dH2O中

3.  PBS/ 1 % BSA: 0.1 mg BSA 溶于10 ml PBS

4.  0.5% Tween-20/1%BSA/PBS: 0.05 ml Tween-20, 0.1 mg BSA 溶于 9.5 ml PBS

5.  1 mg/ml PI储存液: 10 mg PI, 10 ml dH2O

6.  BrdU 在PBS中储存液 pH 7.4 or ddH2O, 过滤器 (MW = 307.1 20 mM = 0.006 g/ml)

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