染色质免疫沉淀技术（ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。

近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围也在不断扩大。那么，在做ChIP实验的过程中，你是否遇到这些问题呢？新手快来进阶吧~

1.非特异性抗体对照背景高

可能原因：

（1）非特异性结合 Protein A 或G beads

（2）ChIP 缓冲液污染了

（3）有些Protein A or G beads 产生高背景

解决办法：

（1）将标本和beads混合孵育1hr后去除，然后再加入抗体进行反应（包括预纯化标本步骤）

（2）重新配制新的缓冲液

（3）有些Protein A/G beads 产生高背景.尽量使用在非特异性对照中背景很低的Protein A/G beads

2.背景高、电泳结果难以分辨大小

可能原因：DNA片段太大

解决办法：对不同类型的细胞，DNA 片段化过程要进行优化。破碎后的DNA片段不应该大于1.5 kbp. 如果使用酶消化染色质的话，应该可以看到单个核小体的存在 (175 bp)

3.信号弱

可能原因及解决办法：

（1）染色质的片段太小了。 染色质超生破碎的大小不能小于500bp。太小的片段会使的核小体被误认为核小体间的DNA而被消化掉。如果做N-ChIP，酶切反应足够来片段化染色质了。

（2）如做的是X-ChIP,有可能是细胞被交联太久。 用甲醛交联10-15分钟然后用PBS洗涤。细胞可能需要用甘氨酸处理以去除多余的甲醛.过度的交联会封闭抗原结合表位从而降低抗体的结合。

（3）染色质用量不足。推荐每次实验染色质的用量是25 μg

（4）免疫沉淀用抗体量不足。推荐使用3-5 μg抗体进行初次实验，如果没有信号则可以增加到10μg的用量。

（5）特异性的抗体结合被清除了。洗液中的NaCl 浓度不能高于500 mM ，因为这个浓度过强，有可能会消除特异性的抗体结合。

（6）细胞没有被完全裂解。推荐使用RIPA buffer裂解细胞（参考X-ChIP方法）。

（7）目标区域没有抗体被富集。 抗体结合表位不存在感兴趣的DNA区域。使用阳性对照抗体，以保证整个操作过程的正确性，如H3K4me3/H3K9me3抗体对应active/inactive promoters。

（8）不适合使用N-ChIP方法。当待测蛋白和DNA的结合比较弱或者离DNA比较远时，最好使用X-ChIP。因为交联可以避免在操作过程中蛋白质从DNA上脱落下来。而Histones通常具有很强的DNA亲和力，因此分析时常用N-ChIP。

（9）所选的单克隆抗体可能不适合X-ChIP方法。 在交联过程中，可能抗体的结合表位被封闭了。推荐使用多克隆抗体，因为具有多个抗原结合表位从而增加了IP靶蛋白的成功率。

（10）使用了错误的抗体亲和beads。 Protein A和G结合不同的Ig. 选择使用能有效结合抗体的Protein beads。推荐使用protein A和G的葡聚糖混合物从而增加沉淀抗体的成功率。

4.PCR扩增出现问题

可能原因及解决方法：

（1）所有标本包括模板对照 PCR结果信号均过高。real-time PCR溶液污染了，换用新鲜配制的新溶液重新进行PCR。

（2）标本PCR结果阴性。使用 standard/input DNA确认引物是否正确。

5.为什么阴性对照还是会有条带呢？

(1) 首先阴性对照有条带是可以理解的，只要是比你的特异样品条带弱很多（几倍）。其次光优化PCR条件没多大意义，主要还是ChIP，这一步要控制好。

(2) 稀释模板量，最好是梯度稀释，1：10，1：50，1：100等等，在某一个浓度下，条带应该就减弱或者消失了。

(3) 检查下阴性对照是否会与DNA有非特异结合，排除阴性对照的污染，选择合适的浓度加入。再检查后面的步骤是不是引入了污染。

6.引物最佳设计是什么样的？

引物长度应为24个核苷酸，应含有50%GC碱基对，Tm值为60°C。不要扩增大于600-800个核苷酸的序列。不必考虑基因组内不独一序列。

7.ChIP超声波的最佳条件？

（1）确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物，避免有气饱（气泡产生）。超声波仪会替你做这些。

（2）脉冲应在~10秒（与体积一致）。

（3）样品量小于400 uL间隔应大于1分钟，在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。

（4）避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部（不能让探头碰到管壁）。

（5）若发现泡沫，立即停止超声，置于冰上。旋转EP管以去除泡沫，继续超声。

（6）在按“开始”键之前将探头置于液体中。

8.逆转交联的时间和温度能改吗?

并不推荐少于4个小时的逆转交联. 但是, 可以将样本在65度过夜逆转交联.需要注意的是,样品不能干掉。

9.做组蛋白ChIP需要交联?

native ChIP中, Histone H3 and Histone H4 都不需要交联反应, 因为它们本身来说和DNA结合的非常紧密. 组蛋白H2A和H2B并不是紧密联接,但是在native ChIP中依然可以不需要交联反应。（请ChIP初学者尤其注意此条！）

10.为什么需要用经验证的抗体？

抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的，有的抗体识别的抗原表位比较小，不容易暴露，在ChIP实验中容易被DNA包裹，从而使抗体无法结合，因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的，商业化的抗体都应该是验证过的。

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