一、实验前准备

1. 材料与试剂

①.细胞样本：培养于共聚焦小皿或盖玻片的细胞，细胞密度应控制在70% - 80%之间，以确保细胞状态良好且分布均匀，便于后续的染色和观察。

一抗：选用两种不同种属来源的抗体，例如兔源的Anti-Protein A和小鼠源的Anti-Protein B，以避免后续二抗之间的交叉反应，确保实验结果的特异性和准确性。

②.二抗：选择与一抗种属匹配的荧光标记二抗，如Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG，荧光标记的二抗能够特异性地结合一抗，通过荧光信号的检测实现对目标蛋白的定位和表达水平的分析。

2.试剂：

①4%多聚甲醛（PFA）：用于细胞固定，能够快速穿透细胞膜，与蛋白质中的氨基等基团发生交联反应，使细胞结构和蛋白抗原得以固定和保存，防止细胞在后续操作过程中发生溶解或变形。

②0.1% - 0.3% Triton X-100（通透液）：用于细胞膜的通透处理，使通透液中的成分能够进入细胞内部，使抗体等试剂能够与细胞内的目标抗原充分接触，从而提高染色的效率和特异性。

③5% BSA/PBS封闭液：用于封闭非特异性结合位点，防止一抗和二抗等试剂与细胞表面的非特异性位点发生非特异性结合，降低背景信号，提高实验结果的信噪比。

④DAP1（1μg/mL）：作为细胞核染色剂，能够与细胞核中的DNA特异性结合，发出蓝色荧光，便于在荧光显微镜下观察细胞核的位置和形态，为后续的双染结果分析提供细胞核的定位参考。

⑤抗荧光淬灭封片剂（如kaLog Diamond）：用于封片，能够有效地防止荧光信号的淬灭，延长荧光信号的保存时间，确保在后续的观察和拍照过程中能够获得清晰、稳定的荧光图像。

⑥其他：PBS缓冲液用于细胞洗涤和试剂配制，摇床用于细胞固定和通透处理时的轻柔震荡，湿盒用于存放染色后的细胞样本，防止样本在观察前干燥，避光铝箔纸用于保护样本免受光照，防止荧光信号的光漂白，移液器用于精确取液，封口膜用于密封试剂瓶和样本容器，防止试剂挥发和样本污染。

3. 设备调试

提前开启共聚焦显微镜，校准激光通道（488nm、594nm、405nm），确保荧光通道无串色。通过校准激光通道，可以保证不同荧光标记的信号能够准确地被检测到，并且避免不同荧光信号之间的相互干扰，从而获得清晰、准确的双染荧光图像，为后续的实验结果分析提供可靠的技术支持。

二、实验步骤

1. 细胞固定

操作步骤

吸除细胞培养基，使用预冷的PBS缓冲液轻柔洗涤细胞3次，每次1分钟（在摇床上低速摇晃），以去除细胞表面的残留培养基和杂质。

加入4%多聚甲醛（PFA，预冷至4℃），在室温下固定细胞15分钟（或在4℃下固定30分钟），以固定细胞结构和蛋白抗原。

固定完成后，去除PFA，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟，确保彻底去除残留的固定液，防止对后续实验步骤产生干扰。

关键点

避免过度固定，固定时间超过20分钟可能导致抗原表位掩蔽，影响后续抗体的结合。

若检测膜蛋白，可省略后续的通透步骤，因为膜蛋白位于细胞膜表面，无需通透即可与抗体结合。

2. 细胞通透（可选）

操作步骤

加入0.1% - 0.3% Triton X-100（溶于PBS缓冲液），在室温下通透细胞10分钟，使细胞膜通透，便于抗体进入细胞内部与胞内抗原结合。

通透完成后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟，去除残留的通透液。

关键点

检测胞内抗原（如核蛋白、细胞骨架）时需要进行通透处理，而膜蛋白则无需通透。

注意Triton X-100的浓度和通透时间，浓度过高或时间过长可能会破坏细胞形态，影响实验结果。

3. 封闭

操作步骤

加入5% BSA/PBS封闭液，室温下封闭1小时（或4℃过夜），以封闭非特异性结合位点，减少背景信号。

封闭完成后，吸去封闭液，无需洗涤，直接进行下一步操作。

关键点

BSA可以替换为与二抗同源的血清（如10%山羊血清），以进一步减少非特异性结合。

确保封闭彻底，否则可能导致非特异性染色，影响实验结果的特异性和准确性。

4. 一抗孵育

操作步骤

采用双抗湿合法：将两种一抗按最佳稀释比例混合于封闭液中（例如，兔抗A 1:200 + 小鼠抗B 1:100）。

滴加混合一抗液覆盖样本，放入湿盒，4℃孵育过夜（或室温2小时），使一抗与目标抗原充分结合。

孵育完成后，回收一抗（可重复使用3 - 5次），用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次10分钟（在摇床上中速摇晃），去除未结合的一抗。

关键点

一抗浓度需要通过预实验进行优化，以确保最佳的染色效果。

避免交叉反应，确保两种一抗来自不同的种属。如果两种一抗种属相同，则需采用分步染色法（先染第一种抗原，酸洗脱后再染第二种抗原）。

5. 二抗孵育

操作步骤

按照说明书将两种二抗稀释于封闭液中（例如，Alexa Fluor 488抗兔1:500 + Alexa Fluor 594抗小鼠1:500）。

滴加混合二抗液，放入湿盒，室温下避光孵育1小时，使二抗与一抗结合。

孵育完成后，吸去二抗，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次10分钟（严格避光），去除未结合的二抗。

关键点

二抗需避光保存，稀释后应现配现用，以保证其活性和荧光强度。

不同荧光通道的二抗发射波长需间隔至少50nm（如488nm与594nm），以避免荧光信号的串色。

6. 核染色与封片

操作步骤

滴加DAPI（1μg/mL）覆盖样本，室温下避光孵育5分钟，对细胞核进行染色。

用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟，去除未结合的DAPI。

吸去多余液体，滴加抗荧光淬灭封片剂，覆盖盖玻片（避免产生气泡），封口膜密封边缘。

将样本避光保存于4℃或立即进行成像分析。

关键点

DAPI染色后需严格避光，以防止荧光信号的光漂白。

确保封片剂覆盖整个样本，避免样本干燥，同时防止盖玻片与样本之间产生气泡，影响成像质量。

三、注意事项

1. 对照实验

①.阴性对照：不加一抗，以排除非特异性结合和自发荧光的影响。

②.单染对照：仅使用一种一抗和对应的二抗，分别进行染色，以排除交叉反应和其他干扰因素。

2. 荧光保护

①.操作避光：在实验操作过程中，尤其是在二抗孵育后，需全程避光操作，避免荧光信号的光漂白。

②.封片保存：封片后的样本需在-20℃下长期保存，以防止荧光信号的淬灭和背景噪声的增加。

3. 图像采集

①.荧光通道顺序：按照从长波长到短波长的顺序（594nm→488nm→405nm）依次采集图像，这有助于减少由于荧光信号重叠而产生的串色干扰，保证图像的清晰度和准确性。

②.成像参数优化：在采集图像时，注意选择合适的激光强度和曝光时间，以获得最佳的图像效果。

4. 常见问题及解决方法

信号弱：

可考虑延长一抗孵育时间或提高一抗浓度，以增强信号强度。

同时，可预实验优化二抗的浓度，确保其与一抗的结合效率。

背景高：

增加洗涤次数或延长洗涤时间，以减少非特异性结合。

适当延长封闭时间，确保非特异性结合位点被充分封闭。

优化二抗的稀释比例，确保其浓度适宜，避免过高浓度导致的背景染色。

交叉染色：

检查一抗的种属来源，确保两种一抗来自不同的种属，以避免交叉反应。

若两种一抗种属相同，可采用分步染色法，先染第一种抗原，酸洗脱后再染第二种抗原，或者使用不同荧光标记的一抗进行直接染色。

荧光淬灭：若样本在采集图像时荧光信号明显减弱，可能是荧光淬灭导致。可增加封片时抗荧光淬灭封片剂的用量，确保样本完全被覆盖，减少样本暴露于空气中的时间，降低荧光淬灭的可能性。

细胞实验外包   想了解更多请关注：https://www.do-gene.cn/